移植液体活检 | 器官健康状态监测的分子听诊器
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本文转载自丁香园
【背景】
器官移植被誉为液体活检时代的三大应用领域之一，是继无创产前筛查（NIPT）、循环肿瘤DNA检测之后，下一个液体活检应用的新兴方向。据Piper Jaffray发布的投资报告显示，预计2026年全球器官移植液体活检市场可达20亿美元，与NIPT市场体量相当。游离DNA（cfDNA）是器官移植液体活检方向的主要生物标志物，美国、加拿大、欧洲等先后有多家公司发布了基于供体来源cfDNA的肾移植无创检测产品，截止目前，累计服务近5万例患者，涉及全球200多家移植中心。近两年来，供体来源cfDNA成为移植肾损伤检测领域的研究热点，特别是在精准诊断排斥反应上的临床数据不断丰富，显示出供体来源cfDNA在移植肾损伤检测上的巨大临床应用潜力。
本期我们就供体来源cfDNA在移植肾排斥反应上的研究进展，采访了本领域国内前沿专家-东部战区总医院肾脏病中心程东瑞教授，为我们分享供体来源cfDNA在移植肾排斥反应方向的最新国际研究数据。
Q：程主任，您好！最近看到您参加了哥本哈根的欧洲器官移植年会（ESOT），向全球的器官移植专家分享了ddcfDNA在移植肾抗体介导排斥反应（AMR）研究中的最新数据。能否请您给大家解释一下为什么会选用ddcfDNA来作为移植肾AMR监测的标志物呢？
A：ddcfDNA的全称是donor-derived cell-free DNA，中文名是供体来源游离DNA，是指器官移植术后患者循环体液中来自于供体细胞凋亡或坏死的游离DNA，其带有供体组织的健康信息。研究表明，肾移植受者体内的ddcfDNA浓度与移植肾损伤密切相关。因此可以通过检测ddcfDNA获知移植肾的健康状态。cfDNA生物学性质相对稳定、易于保存运输，其半衰期短，可以反映患者实时的健康状态。另外cfDNA广泛存在于人体血液、尿液中，采集方便、无创。
Q：与我们目前临床常规检测排斥的方法相比，如血清肌酐、PRA、供体特异性抗体（DSA）及肾活检等，检测ddcfDNA的临床优势有哪些？
A：血清肌酐指标带有滞后性且特异性不高。肾组织活检具有侵入性和并发症风险，且临床判断依赖病理医生的经验，另外由于病理取材不均一，以及病变进展的早晚期，仍有假阴性结果存在，数据表明穿刺假阴性率在20%-30%。
DSA指标对AMR的阳性预测值（PPV）较低，我们的研究数据和国际已报道的数据都显示，DSA的PPV只有40%-45%。说明有时候DSA只是游离状态，并不一定会激活血管内皮细胞的损伤通路（补体依赖途径，与细胞表面抗原直接作用途径和募集炎症细胞途径）。另一方面，非HLA抗体（MICA、MICB等）约占DSA的10%-40%，而目前DSA主要使用Luminex-单抗原微珠法平台来检测HLA相关的抗体，因此具有较高的假阴性率。最后对于部分供体HLA基因分型不明确的患者，其PRA阳性时，也较难确定是否存在DSA。
ddcfDNA是血管内皮损伤的早期结果，而不是可能的原因，不管HLA或非HLA抗体介导的AMR都可以造成其变化。我们的研究数据和国际已报道的数据都显示，ddcfDNA的PPV可达到90%，远高于单独DSA诊断AMR的阳性预测值（～40%）。另外ddcfDNA反映了移植肾损伤的整体部位，并不存在采样的异质性。
Q：ddcfDNA在检测AMR和T细胞介导的排斥反应（TCMR）上有什么不同吗？
A：AMR和TCMR在血浆ddcfDNA浓度变化上是不一样的，血浆ddcfDNA浓度在AMR患者中要高于TCMR患者。依据Banff（2013）标准，AMR主要造成血管内皮损伤，其血管内皮细胞凋亡后产生的cfDNA直接进入循环血液中。而TCMR主要损伤部位是肾小管和肾间质，小管上皮细胞凋亡坏死入血则需要跨过血管屏障。对于TCMR中IB级以上排斥（伴有动脉内膜炎），已有研究结果表明血浆ddcfDNA显著升高。排斥反应类型的进一步鉴别需要利用多维样本（尿液和血液）中的ddcfDNA信息来分析不同损伤部位。
Q：怎么利用ddcfDNA来判断排斥反应发生的风险？是否可以分享相关的临床案例？
A：不同的研究结果显示对于检测排斥反应时血浆ddcfDNA浓度的cut-off值是略有差别的：目前一项由美国华盛顿大学医学院主导的研究显示以血浆ddcfDNA>1%作为阈值来诊断排斥反应发生时，敏感度可达到81%，特异性达到82%，AUC为0.86。而由Cedars-Sinai Medical Center主导的研究表明诊断排斥的AUC可达0.82，当血浆ddcfDNA≥0.74%，检测敏感度可达到100%，特异性为71.8%。另一项由墨尔本大学主导的研究表明诊断排斥的AUC可达0.91，当血浆ddcfDNA>0.75%，检测敏感度为85%，特异性为75%。我们在中国88例肾移植患者中的研究结果显示，利用血浆ddcfDNA检测排斥时AUC为0.952，当血浆ddcfDNA>0.96%，检测敏感度可达到90%，特异性可达到96%。
我们在临床中曾遇到一例女性肾移植患者，在2009年3月份做完移植术后稳定肌酐65 μmol， 今年3月份肌酐为61.5 μmol，尿蛋白+，临床无其他异常。此时我们做ddcfDNA检测，结果血浆ddcfDNA的浓度3.72%，提示AMR高风险。我们进一步作了穿刺活检显示，该患者是慢性移植肾肾小球病，与2010-01-02切片比较，肾小球系膜增生伴肾小球炎，球性废弃。少量管周毛细血管炎，肾小管间质轻度病变（15%），动脉透明变性和硬化。最终临床判断为亚临床排斥。这个案例可以表明，利用血浆ddcfDNA可以早期检测出亚临床排斥。
Q：目前国际上检测ddcfDNA的主要方法是什么？
A：目前国际上ddcfDNA检测的主流技术是下一代高通量基因测序平台（NGS）。NGS是生命科学以及医学研究领域最新革命性技术，检测范围广、特异性强、灵敏度高。可一次性检测几千甚至几万个SNP位点，定量结果准确。另外ddcfDNA检测方法还包括qPCR、多重PCR、数字化PCR等，不同的ddcfDNA的定量方法对检测结果有一定影响。
利用NGS技术还可以同时诊断出BK病毒风险、病原微生物感染、移植肾功能延迟恢复（DGF）等，可更全面提示发生移植肾损伤的原因。
Q：您认为，ddcfDNA检测在这个领域未来的发展方向主要是什么？
A：目前主要靠ddcfDNA浓度单一指标来划分排斥反应和非排斥反应，未来基于ddcfDNA并结合其他临床指标预测排斥反应发生风险度的研究模式，将更科学准确。对于排斥反应类型的鉴别需要进一步利用多维样本中的ddcfDNA信息来分析不同损伤部位。另外其他具有组织特异性的表观遗传学特征，如cfDNA甲基化、microRNA、核小体图谱等，在将来不同排斥反应损伤部位的研究中具有巨大潜力。最后针对ddcfDNA在排斥反应患者治疗后的动态变化规律，还需要更多的研究数据。
非常感谢程教授此次接受我们的采访，通过本次采访我们了解到供体来源游离DNA在监测移植肾损伤方面具有非常重要的作用，可以更早期发现移植肾排斥反应，特异性高。希望未来可以有更多这方面的研究，帮助患者更好的监测肾健康状态，为患者的生命健康保驾护航。
参考文献：
1. 程东瑞等，供体来源游离DNA在移植肾损伤中的研究进展 [J]. 中华器官移植杂志（2019）
2. Lo YM, et al. Presence of donor specific DNA in plasma of kidney and liver transplant recipients[J]. Lancet (1998)
3. Roy D. Bloom et al. Cell Free DNA and Active Rejection in Kidney Allografts [J]. JASN (2017)
4. Whitlam JB, et al. Diagnostic application of kidney allograft-derived absolute cell-free DNA levels during transplant dysfunction [J]. AJT（2019）
5. Huang E, et al. Early clinical experience using donor-derived cell-free DNA to detect rejection in kidney transplant recipients [J]. AJT（2019）
